小編之前寫過(guò)一篇關(guān)于白色PCR管和透明PCR管相比較的文章，之后就有很多小伙伴@小編，詢問(wèn)除了顏色不同外，為什么實(shí)驗(yàn)室里的大師兄都開(kāi)始用0.1ml的PCR管了？普通0.2ml管和0.1ml管對(duì)qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有什么不同的影響嗎？
首先，我們先來(lái)看一下市場(chǎng)上這些主流qPCR儀，比如國(guó)外的ABI（賽默飛）的7500 Fast，Roche的LightCycler96和LightCycler480，Bio-Rad的CFX96 Touch，安捷倫的AriaMx等以及國(guó)內(nèi)的朗基Q1000/Q1000+和Q2000系列，它們都已經(jīng)以0.1ml管為標(biāo)配耗材，像賽默飛更是向定量PCR用戶推薦優(yōu)先選擇低容（0.1ml）耗材。趨勢(shì)已來(lái)，勢(shì)不可擋。
那么在定量PCR實(shí)驗(yàn)中，為什么0.1mlPCR管比普通0.2ml管有著天然的優(yōu)勢(shì)呢？且聽(tīng)小編慢慢道來(lái)。
首先我們看外形，普通管要比0.1ml管高很多（見(jiàn)圖1）。
而恰恰因?yàn)閮烧吒叨壬系牟町悾炀土?.1ml管即將擁有開(kāi)掛的一生。
Ø 縮小死體積，避免掛壁冷凝水
當(dāng)加入同樣體積的反應(yīng)液時(shí)，相比0.2ml管，0.1ml管的反應(yīng)液上方空間（也稱死體積)則相對(duì)小得多，浪費(fèi)的空間就更少（見(jiàn)圖2）。實(shí)驗(yàn)中隨著樣品臺(tái)逐漸升溫，管內(nèi)加熱后產(chǎn)生的水蒸氣會(huì)進(jìn)入上方空間，普通管容納了更多的水蒸氣，導(dǎo)致反應(yīng)液被濃縮，反應(yīng)液成分的變化進(jìn)而影響到導(dǎo)熱性和液體溫度，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和精確性。相反，對(duì)于0.1ml管來(lái)說(shuō)，就會(huì)大大減少死體積，使得反應(yīng)成分更穩(wěn)定，重復(fù)性更好。
另外，由于普通管中的水蒸氣要經(jīng)過(guò)更長(zhǎng)距離的裸露部分才能到達(dá)頂部的熱蓋處（見(jiàn)圖3），不可避免地導(dǎo)致一些冷凝水掛壁現(xiàn)象的形成，這對(duì)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)是致命的。因?yàn)閽毂诘睦淠拖褚粋€(gè)個(gè)微型透鏡，造成熒光的折射和散射，劣化并衰減檢測(cè)器信號(hào)的一致性，降低靈敏度。
而0.1ml管由于被樣品臺(tái)充分包裹，裸露在樣品臺(tái)外面的部分極少，與熱蓋的距離也更近，大大降低了掛壁冷凝水的產(chǎn)生，以及冷凝水污染的可能性，當(dāng)然實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)就更準(zhǔn)確啦。
圖2
圖3
Ø 短光程，提高熒光捕獲率
由于試劑成本越來(lái)越高，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的反應(yīng)體積越來(lái)越小，蕞常見(jiàn)就是20-25ul，甚至在定量PCR實(shí)驗(yàn)中，5-10ul的用戶也是屢見(jiàn)不鮮，對(duì)0.1ml管來(lái)說(shuō)綽綽有余，即使加50ul 也不在話下（見(jiàn)圖4）。
對(duì)于頂部檢測(cè)的熒光定量PCR儀來(lái)說(shuō)，在同等體積下，從激發(fā)光進(jìn)入反應(yīng)液到產(chǎn)生的熒光被探測(cè)器接收，PCR管的高度越低，光經(jīng)過(guò)的路程（即光程）就越短，（0.1ml管比普通管的光程縮短達(dá)10.6mm），檢測(cè)器的熒光捕獲率就更高，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就越美麗。
圖4
總之，當(dāng)聯(lián)合使用0.1ml管和白管時(shí)，更可以發(fā)揮1+1>2的效果，即使在2.5-5ul的極限體積下，也可以得到較好的擴(kuò)增曲線，有圖為證（見(jiàn)圖5）。
2.5ul 10倍稀釋樣品擴(kuò)增曲線
圖5 5ul 四通道多重試劑擴(kuò)增曲線
現(xiàn)在小伙伴們明白了為什么qPCR高手都愛(ài)用0.1ml PCR管了吧
。也許你還習(xí)慣使用普通管，小編寫此文就是希望能讓你改變思路，擁抱未來(lái)呢。
正所謂濃縮的皆是“精華”——0.1ml管（白管更佳）將是熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)成功的致勝法寶！
